動(dòng)物癥狀觀察：

表現(xiàn)為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個(gè)月后死亡。

實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ILAS-GC-2012-001)。

（一）GRK4γ wt/R65L/A142V/A486V 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型及表型

提取小鼠基因組DNA，用PCR法擴(kuò)增623bp的目的片段，鑒定小鼠基因型（圖1A）。提取心臟、腎臟和腎上腺組織總蛋白，用GRK4抗體進(jìn)行Western Blot分析，確定轉(zhuǎn)基因小鼠GRK4的高表達(dá)（圖1B）。通過比較對(duì)照組（NTG）和轉(zhuǎn)基因小鼠中GRK4表達(dá)水平，篩選到在心臟、腎臟和腎上腺均高表達(dá)GRK4基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。

圖1 GRK4γ野生型基因和三種GRK4γ基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

A. PCR鑒定GRK4γ野生型基因和三種GRK4γ基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠基因型；1為空白對(duì)照；2為陰性對(duì)照；3為陽性對(duì)照；5、8、11、13為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；4、6、7、9、10、12為陰性轉(zhuǎn)基因小鼠。

B. Western Blot分析GRK4蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟、腎臟和腎上腺組織中的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參；

（二）正常飲食GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析

NTG 和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠于2、4和8月齡進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，NTG和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠平均動(dòng)脈血壓（mean arterial pressure, MBP）[平均動(dòng)脈血壓＝舒張壓＋1/3（收縮壓﹣舒張壓）]均隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。與NTG小鼠相比，GRK4γ野生型和GRK4γR65L轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常；GRK4γA142V轉(zhuǎn)基因小鼠在8月齡時(shí)血壓顯著升高（P=0.009）；而GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下并未出現(xiàn)高血壓表型（圖2）。說明，外源性轉(zhuǎn)入人源GRK4γ野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突變不會(huì)影響正常鈉鹽攝入情況下血壓水平，而GRK4γA142V突變即使在正常鈉鹽攝入情況下仍會(huì)引起血壓升高。

圖2 正常飲食GRK4γ野生型基因和三種GRK4γ基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析（注：*P<0.01；**P<0.01）

（三）高鹽飲食GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析

于2月齡時(shí)將NTG和GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成四組，即NTG正常飲食組（N=8）、GRK4γA486V正常飲食組（N=5）、NTG高鹽飲食組（N=6）和GRK4γA486V高鹽飲食組（N=6）。正常膳食飲食組飼料中氯化鈉含量為0.06%，高鹽飲食組飼料中氯化鈉含量為4%，連續(xù)喂養(yǎng)4周后恢復(fù)正常飲食，并對(duì)各組小鼠進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過高鹽飲食刺激，與正常飲食組NTG小鼠相比，高鹽飲食組NTG小鼠MBP雖有所升高但無顯著性差異；而高鹽飲食組GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠較正常飲食組GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠MBP顯著升高（P=0.0007），且MBP變化值為7.53mmHg（圖3）。臨床上，將因鈉鹽攝入量增多而導(dǎo)致的MBP升高值≥ 7mmHg的高血壓定義為鹽敏感性高血壓。由此可知，GRK4γA486V突變誘導(dǎo)高血壓屬于鹽敏感性高血壓。

圖3 高鹽飲食GRK4γA486V轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析

多巴胺和腎素-血管緊張素系統(tǒng)是兩個(gè)最主要的血壓調(diào)控途徑，二者與細(xì)胞間第二信使系統(tǒng)協(xié)同調(diào)節(jié)體內(nèi)水鈉平衡，GRK4（G蛋白偶聯(lián)受體激酶4G-protein-coupled receptor kinase 4, GRK4）則在多巴胺介導(dǎo)的尿鈉排泄中發(fā)揮重要的作用。GRK4是唯一有4個(gè)剪接變異體（GRK4α,β, γ和δ）的GRKs家族成員，編碼GRK4的基因定位4p16.3，該位點(diǎn)已被證實(shí)與高血壓的發(fā)生相關(guān)。GRK4的突變與腎臟促尿鈉排泄功能受損和高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，其中R65L（rs2960306）、A142V（rs1024323）和A486V（rs1801058）是現(xiàn)階段研究頻率較高的三個(gè)突變。在對(duì)中國(guó)北方漢族人群的研究中發(fā)現(xiàn)，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同時(shí)存在可使高血壓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較無突變?nèi)巳焊?倍。

目前建立的人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四種基因轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)其進(jìn)行血壓動(dòng)態(tài)對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRK4γ野生型和GRK4γR65L突變轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常；GRK4γA142V突變轉(zhuǎn)基因小鼠在正常的鈉鹽攝入情況下即可發(fā)生高血壓，而GRK4γA486V突變轉(zhuǎn)基因小鼠只有在增加鈉鹽攝入情況下才發(fā)生高血壓，說明GRK4γ的不同突變會(huì)引起不同類型的高血壓。

用PCR的方法克隆人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四種基因的開放閱讀框，，均插入系統(tǒng)性表達(dá)的啟動(dòng)子下游構(gòu)建人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四種表達(dá)載體。用顯微注射法將四種轉(zhuǎn)基因載體分別注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備四種轉(zhuǎn)基因小鼠。

一、疾病名稱

高血壓是以體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管病之一，目前高血壓患者約有10億，如不采取積極有效的預(yù)防措施，預(yù)計(jì)到2025年，的高血壓患者可能會(huì)再增加80%。此外，高血壓還是腦卒中、心肌梗死等心血管疾病以及慢性腎臟疾病等最主要的危險(xiǎn)因素。因此，高血壓已經(jīng)成為威脅人類生命健康的重要的公共衛(wèi)生問題，其防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

二、疾病臨床表現(xiàn)及致病機(jī)制

高血壓的癥狀因人而異。早期可能無癥狀或癥狀不明顯，僅僅會(huì)在勞累、精神緊張、情緒波動(dòng)后發(fā)生血壓升高，并在休息后恢復(fù)正常。隨著病程延長(zhǎng)，血壓明顯的持續(xù)升高，逐漸會(huì)出現(xiàn)各種癥狀。此時(shí)被稱為緩進(jìn)型高血壓病。緩進(jìn)型高血壓病常見的臨床癥狀有頭痛、頭暈、注意力不集中、記憶力減退、肢體麻木、夜尿增多、心悸、胸悶、乏力等。當(dāng)血壓突然升高到一定程度時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)劇烈頭痛、嘔吐、心悸、眩暈等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生神志不清、抽搐。這就屬于急進(jìn)型高血壓和高血壓危重癥，多會(huì)在短期內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的心、腦、腎等器官的損害和病變，如中風(fēng)、心梗、腎衰等。癥狀與血壓升高的水平并無一致的關(guān)系。

高血壓有兩種情況，一種是原發(fā)性高血壓，一種是繼發(fā)性高血壓。基于目前的醫(yī)學(xué)發(fā)展水平和檢查手段，能夠發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致血壓升高的確切病因，稱之為繼發(fā)性高血壓；反之，不能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致血壓升高的確切病因，則稱為原發(fā)性高血壓，占血壓高總?cè)藬?shù)的90%～95%。高血壓人群中多數(shù)為原發(fā)性高血壓，但明確診斷原發(fā)性高血壓，需首先除外繼發(fā)性高血壓。繼發(fā)性高血壓是由于某種具體的疾病引起的血壓高，病因是清楚而明了的，大約占高血壓總數(shù)的5%～10%，一般多由腎實(shí)質(zhì)病變、腎動(dòng)脈狹窄、嗜鉻細(xì)胞瘤、原發(fā)性醛固酮增多癥、庫(kù)欣綜合征、主動(dòng)脈縮窄等疾病引起。

目前認(rèn)為原發(fā)性高血壓是一種某些先天性遺傳基因與許多致病性增壓因素和生理性減壓因素相互作用而引起的多因素疾病。這些因素主要包括：遺傳因素；高鈉、低鉀膳食；超重和肥胖；飲酒；精神緊張及其他危險(xiǎn)因素包括年齡、缺乏體力活動(dòng)等。

2005年美國(guó)高血壓學(xué)會(huì)（ASH）提出，高血壓是一個(gè)由許多病因引起的處于不斷進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的心血管綜合征，可導(dǎo)致心臟和血管功能與結(jié)構(gòu)的改變。因此，原發(fā)性高血壓治療的主要目的是最大限度地降低心血管的死亡和病殘的總危險(xiǎn)。