為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細胞的數(shù)量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結(jié)果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動物模型的制備和應(yīng)用實驗必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實驗室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1.模型的皮膚特征

兔耳緣靜脈及皮內(nèi)注射卵白蛋白生理鹽水溶液后，皮膚注射部位均會出現(xiàn)直徑1 cm左右的皮丘，6 h后模型組兔的背部皮丘逐漸變大，且周圍水腫，皮內(nèi)血液滲出；至18h左右，呈現(xiàn)片狀紫斑，直徑2-10mm，形狀不規(guī)則，大小不等，還有一些斑點出現(xiàn)在耳朵和腿部（圖1）。在激發(fā)第8天左右，皮膚紫癜開始變小，滲出減少，20天左右，癥狀明顯改善。皮膚癥狀出現(xiàn)的比例約為85%。

注：a、對照組兔的背部皮膚b、模型組兔的背部皮膚

圖1 激發(fā)后兔的外部特征觀察

2.模型病理特征

（1）臟器組織形態(tài)學(xué)改變

模型動物病理表現(xiàn)為皮下出血，真皮水腫，血管擴張充血、出血，炎細胞浸潤；腎小球囊腔蛋白滲出物，血管擴張充血及局灶性慢性腎炎，腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜增厚，紅細胞管型，炎細胞浸潤等；還可見到關(guān)節(jié)腔滑膜淤血，結(jié)締組織壞死，炎細胞浸潤等；胃黏膜可見出血，壞死脫落；小腸絨毛血管擴張充血，上皮細胞脫落；肺淤血，肥大細胞似有脫顆粒現(xiàn)象；肝灶性炎細胞浸潤等等（圖2）。

注：a.真皮水腫，炎細胞浸潤；b.真皮血管充血，出血；c.皮膚正常對照；d.腎小球囊腔蛋白滲出物，炎細胞浸潤；e.腎小球系膜增厚，血管擴張；f.腎正常對照；g. 關(guān)節(jié)滑膜淤血，結(jié)締組織壞死，炎細胞浸潤；h.胃黏膜水腫，上皮細胞脫落；i.肺淤血，伴肥大細胞脫顆粒。

圖2 過敏性紫癜兔模型的組織病理改變

（2）皮膚、腎臟免疫復(fù)合物沉積

免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)IgA免疫復(fù)合物在模型組兔皮膚主要沉積在皮膚真皮層血管壁、腎小球系膜區(qū)，血管壁及腎小球入球小動脈壁，常呈斑點狀、團塊狀、分支狀或短線狀分布（圖3）。

注：a.模型組兔皮膚組織，b. 對照；e.模型組兔腎臟組織，f 對照。

圖3 皮膚和腎臟的免疫熒光檢測

（3）腎小球纖維增生性改變

腎臟Masson染色結(jié)果顯示模型組動物（a）腎小球系膜纖維化增生，膠原纖維蛋白增多，使得系膜增厚，基質(zhì)增多，與（c）圖PAS染色結(jié)果模型組兔腎小球系膜增生，系膜基質(zhì)增厚相一致（圖4,5）。

注：圖a, b分別為模型組和對照組兔的腎臟Masson染色；c,d分別為模型組和對照組兔的腎臟PAS染色。

圖4 兔腎臟Masson和PAS染色

圖5 兔腎臟masson和PAS染色單個腎小球內(nèi)膠原蛋白及糖原面積的百分比

（4）皮膚和肺臟的嗜酸性細胞浸潤

嗜酸性粒細胞的皮膚（圖a,b）和肺臟（圖c,d）Luna染色，表現(xiàn)為單位面積（1mm2 ×40倍）視野內(nèi)模型組兔皮膚真皮層和肺間質(zhì)內(nèi)嗜酸性粒細胞明顯增多（圖6,7）。

圖a（模型組），b（對照組）為皮膚Luna染色；圖c（模型組），d（對照組）為肺組織Luna染色

圖6 兔皮膚和肺組織的Luna染色

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對于對照組

圖7 兔皮膚和肺組織的Luna染色單位面積嗜酸性粒細胞含量

（三）血尿常規(guī)及便潛血改變

血白細胞WBC升高，RBC相對于減少，PLT數(shù)量激發(fā)后無差異性改變，NEU、NEU%均升高，EOS、EOS%升高（圖8）。尿液變稠表面觀察有拉絲現(xiàn)象，氣味大，67%尿蛋白陽性，尿紅細胞陽性；實驗前便潛血檢測陰性，激發(fā)實驗后70%便潛血陽性。

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對于對照組.

圖8 過敏性紫癜兔模型血常規(guī)改變

長春中醫(yī)藥大學(xué)4～12歲，住院 2～5天的12名患者血常規(guī)檢測白細胞（WBC），粒細胞（Gran），單核細胞（MONO）及百分比MONO% 明顯增加，分別超出正常范圍的百分比為33.3% (4/12)，25% (3/12)，41.6% (5/12)，33.3% (4/12)。淋巴細胞百分比（LYMPH%）明顯減少，低于正常參考范圍的比例為25% (3/12)，血小板未見明顯異常改變（表1）。

表1 患者血常規(guī)檢測

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對于對照組.

（四）模型血免疫指標(biāo)改變

HSP兔血清IgA升高，IgG降低，C3，C4減少，IgE無明顯改變（圖9）。外周血CD3+T細胞數(shù)目減少，CD4+T細胞減少，CD8+T細胞增多，CD8+T細胞所占百分比升高，CD4+T細胞百分比下降，IL-2水平下降，TNF-α水平升高（圖10）。

長春中醫(yī)藥大學(xué)4～12歲，住院 2～5天的12名患者血清IgA， IgE升高（p<0.01），IgG升高（p<0.05），C3，C4減少（p<0.05）。血CD4+T細胞百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差別均具有統(tǒng)計學(xué)差異。（圖11,12）

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對于對照組.

圖9 HSP兔模型血清免疫球蛋白和補體改變 圖11 HSP患者血清免疫球蛋白和補體改變

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對于對照組.

圖10 HSP兔模型血免疫細胞及細胞因子的改變

﹡P<0.01，﹡﹡P<0.05，相對于對照組.

圖11 HSP患者血免疫細胞及細胞因子的改變

1．實驗動物

1.5月齡日本大耳白兔24只，12只雌雄各半為模型組，12只雌雄各半為對照組，體重1.2～1.4kg，普通級動物房飼養(yǎng)。

2.模型構(gòu)建

1）過敏體質(zhì)的構(gòu)建

中醫(yī)熱性藥物干姜、蓽茇、胡椒水煎劑以1:1:1的比例混合成15%的水溶液，4℃保存?zhèn)溆谩游镞m應(yīng)1周后，模型組口服給藥，1次/日，連續(xù)3周，對照組給以等量生理鹽水，其它條件相同。

2）抗原致敏

腹腔注射卵白蛋白生理鹽水與弗氏完全佐劑以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，1次/周，連續(xù)3 周。對照組腹腔注射等量的生理鹽水。

3）抗原激發(fā)過敏反應(yīng)

腹腔注射致敏3周后，動物耳緣靜脈和皮內(nèi)分別注射1%和0.3%卵白蛋白生理鹽水，激發(fā)過敏反應(yīng)。之后觀察動物皮膚紅腫狀況，照相存檔。

四、模型主要鑒定方式

非血小板減少性皮膚紫癜癥狀、血尿常規(guī)和便潛血、病理改變（包括炎癥反應(yīng)炎細胞浸潤、IgA免疫復(fù)合物沉積等）、血免疫指標(biāo)（血清IgA及相關(guān)免疫細胞及細胞因子）等。

一、疾病概況

過敏性紫癜（allegric puprura，AP），又稱亨-舒綜合癥（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP），是一種常見的血管變態(tài)反應(yīng)性出血性疾病，以廣泛的小血管炎為病理基礎(chǔ)，皮膚紫癜、消化道粘膜出血、關(guān)節(jié)腫脹和腎炎等癥狀為其主要臨床特征，是兒童中發(fā)病率最高的血管炎性病。流行病學(xué)研究提示，HSP的發(fā)病率為（10~22）/10萬，好發(fā)年齡為3~10歲，并發(fā)癥多，過敏性紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpuranephritis，HSPN）是最嚴(yán)重的并發(fā)癥。該病復(fù)發(fā)率高，病程遷延，患病率逐年升高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其治療無滿意效果。

鑒于直接進行人體實驗的局限性，在很大程度上需要通過動物實驗進行，所以HSP動物模型在整個HSP的研究中具有舉足輕重的作用。目前，關(guān)于過敏性紫癜動物模型構(gòu)建的報道很少，因此對該病病因、發(fā)病機制、臨床治療評價和藥物開發(fā)在一定程度上受到限制。

二、發(fā)病機制

病因不明確，一般認(rèn)為與過敏有關(guān)，致敏原可能為食物、感染、藥物、花粉或昆蟲叮咬等，臨床上常不確定。致敏原進入機體刺激漿細胞，產(chǎn)生抗體，與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，主要是IgA免疫復(fù)合物，過多的免疫復(fù)合物不易被巨噬細胞清除，刺激5-羥色胺、組胺等血管活性物質(zhì)釋放，血管壁通透性增加，組織水腫。免疫復(fù)合物在血管壁或腎小球膜上沉積，產(chǎn)生過敏毒素，使中性粒細胞在沉積處聚集，并釋放蛋白水解酶，局部組織血管損傷加劇，沉積在胃腸黏膜小血管，引起胃腸道出血。該發(fā)病機制類似于可溶性免疫復(fù)合物引起的III型超敏反應(yīng)。然而在相同條件下，很多人接受相同抗原刺激后，并未發(fā)生過敏性紫癜，而有些人則首次接觸這些抗原刺激即可發(fā)生致敏反應(yīng)，說明患過敏性紫癜的人需具備特異反應(yīng)體質(zhì)，并且研究發(fā)現(xiàn)這種特異反應(yīng)體質(zhì)具有家族傾向性，即基因易感性。