動物癥狀觀察：

表現為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統?？諝饨涍^初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

1. 小鼠鑒定結果解讀

圖1.鑒定結果圖。27#，30#，19# KO- PCR 反應可以獲得~559bp條帶； WT- PCR 反應可以獲得422bp 條帶，為雜合子。16# KO- PCR 反應未獲得~559bp條帶； WT- PCR 反應可以獲得422bp 條帶，為野生型。注：數字為鼠尾號，WT為C57BL/6J野生鼠，N為Negative空白對照，M為DNA Marker。2. Cilp2在衰老后表達水平下降 與年輕組相比，男性與女性老年人血漿中Cilp2蛋白水平有顯著降低的趨勢，表明Cilp2在衰老過程可能發揮了作用（圖2）。

圖2：血漿中年輕人和老年人血漿中的Cilp2蛋白質水平。3. Cilp2過表達會改善衰老性心肌肥厚 通過構建Cilp2重組腺相關病毒，尾靜脈注射至衰老小鼠構建Cilp2過表達組。我們發現，衰老小鼠的體重與心重與年輕組明顯增加，而Cilp2過表達組與衰老組相比，心臟重量及心臟重量與脛骨長比值顯著降低(圖3A)。此外，通過小動物超聲機檢測各組小鼠的新功能，我們發現左心室舒張末期直徑(LVSd), 左室后壁厚度(LVPWd)在衰老組顯著增高，表明在衰老后心功能下降；而過表達Cilp2后發現，LVPWd雖沒有統計學差異，但有下降的趨勢，表明Cilp2可以部分減緩衰老過程中的心功能下降(圖3B)。

圖3.Cilp2對衰老心臟功能的影響。（A）體重、心臟重量和心臟重量/肱骨長的差異比較。（B）超聲檢測三組小鼠的LVSD和LVPWd的差異。4. Cilp2對病理性心肌肥厚的影響 通過qRT-PCR檢測心肌肥厚分子標志物發現，與年輕心臟的Cilp2 mRNA水平相比，衰老心臟的Cilp2 mRNA水平呈下降趨勢,過表達組Cilp2 mRNA 顯著增高（圖3）。與病理性的心肌肥厚不同，衰老后的心臟Anp、Bnp無顯著升高；而Mhy6 mRNA 水平下降，Mhy7 mRNA水平升高與病理性心肌肥厚一致。Cilp2過表達組有逆轉Mhy6的趨勢（圖3）。

圖3 通過qRT-PCR檢測Cilp2、Anp、Bnp、Myh6和Mh7的mRNA水平。

1. 項目策略圖 此模型采用CRISPR/Cas9技術對Crtc1基因進行基因編輯，原理示意圖如下：

2. 項目策略概述 利用CRISPR/Cas9技術，設計并體外轉錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現靶位點堿基序列缺失，實現基因敲除。3. gRNA序列信息gRNA1: GCTGTTCAGGATGGGCCAAT (5’ – 3’), PAM: GGG.gRNA2: ACAAGCAGAGCAGGTGGGCG (5’ – 3’), PAM: GGG.4. 建立主動脈縮窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手術），通過超聲心動圖評價心臟功能，小鼠采用異氟脘吸入麻醉，將小鼠左胸前區剃毛，涂抹耦合劑，取仰臥位對小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀（VET V6，VINNO，中國），頻率為12.5 MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量各項指標。5．小鼠心臟組織切片形態及病理檢測 稱取小鼠體重，小鼠經心臟灌注，取出心臟后用濾紙吸干血液后稱重，計算心臟重量與體重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。6．心肌肥厚分子標志物檢測將各實驗組小鼠心室肌組織分別提取總RNA，應用qPCR檢測心肌肥厚指標Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 健康、衰老和壽命是人們最關心的問題，自古以來人們也一直在探索其中的奧秘。隨著我國進入老齡化社會，年齡增長帶來的疾病嚴重威脅人類的健康，但是目前對于衰老的認識還處于初步階段。衰老引起的左心室纖維化、僵硬和室壁增厚，均會引起心肌舒張功能障礙，導致心力衰竭。在衰老的心臟中，心肌細胞的數量可能會隨著年齡的增長而減少，但心臟成纖維細胞會明顯增殖，它可以產生細胞外基質和膠原蛋白。心肌成纖維細胞增殖過多時，會出現膠原的合成與降解失衡，膠原比例失衡、細胞排列紊亂，細胞外基質沉積，這是諸多心血管疾病發展到一定階段共同的病理變化。 目前，心臟衰老及其導致的心肌肥厚的發病機理尚未完全闡明，臨床上缺乏有效的藥物治療手段。因此，探索心臟衰老和衰老性心肌肥厚病理發生的分子機制有助于尋找新的藥物作用靶點，改進抗心臟衰老和衰老性心肌肥厚的治療方案，并推動精準醫療在心臟衰老防治領域的發展。二、模型背景1、Cilp2基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：68709? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/68709? 敲除基因名稱（MGI號）：Cilp2（MGI: 1915959）? 敲除基因Ensembl網址鏈接：? http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000044006;r=8:69880369-69887687;t=ENSMUST00000057831? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）：ENSMUST00000057831.7? 方案敲除的exon：exon 4~62、實驗動物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。 主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 衰老，系指隨著時間的增加，生命體功能衰退的過程[1]。壽命長用做低等模式生物評價衰老最重要的指標；而在高等動物中，細胞、組織與器官結構與功能復雜，單純用壽命作為衰老的唯一指標并無全面，有研究認為，改善衰老相關疾病被認為是減輕衰老的表現[2, 3]。衰老相關的系統性疾病包括：心腦血管疾病、腫瘤、骨關節炎、糖尿病與神經退行性疾病；相關研究也通常會記錄衰老相關疾病的狀態來評價個體衰老的情況[4]。宏觀的生命體系統特征往微觀的細胞與分子活動的表現形式，若透過衰老的生物學特征尋找到衰老的細胞、分子調控機制對于延緩衰老至關重要。經典的細胞衰老是指一種不可逆的細胞周期阻滯機制，相關因素包括：端粒縮短，DNA損傷，活性氧累積，原癌基因與抑癌基因異常活動，代謝改變，未折疊蛋白反應，炎性因子長期刺激，有絲分裂異常造成的應激壓力等[5]。 目前，衰老研究領域也大致分為應激適應、表觀遺傳、炎癥、生物大分子損傷、新陳代謝、蛋白穩態、干細胞與再生七大類[6]。此外，被深入研究過的分子包括p53、p21、p14ARF、p19ARF和p16INK4A因其在衰老過程中發揮了重要作用，已被普遍用作鑒定衰老的標志物[7]。 軟骨中間層蛋白（cartilage intermediate layer protein，Cilp）主要分布在軟骨細胞中，多個組織中均能表達，其中心臟、中樞系統、骨骼肌表達水平較高。目前，關于CILP的研究較少，其中主要涉及骨關節炎、腰椎間盤突觸，研究發現Cilp1與Cilp2與衰老相關疾病骨關節炎相關，Cilp1對骨關節炎有損害而CiLp2對其卻有保護作用[8, 9]。此外，另有研究報道[10-12]Cilp1在缺血-再灌注損傷模型中，Cilp1在脈及左心室中的mRNA和蛋白質的表達水平顯著升高，Cilp1可通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路來抑制成纖維細胞的活化。與Cilp1類似，Cilp2一部分研究主要集中在Cilp2及其單核苷酸基因多態性位點與在骨關節炎的關系；有研究[13]確定了Cilp-2和Pepck存在直接相互作用，并認為Cilp-2在調節肝臟葡萄糖產生中起著重要作用。另有研究發現，Cilp2基因的小t等位基因多態性對血脂和脂蛋白水平的升高有保護作用[14]。 本研究通過前期質譜結果發現，Cilp2在老年人血漿中的蛋白水平顯著降低；此外，通過對衰老小鼠注射Cilp2病毒，發現Cilp2能改善小鼠的心功能。而目前尚未報道Cilp2在衰老心臟過程中的作用，因此本項目擬探究Cilp2對心臟衰老的影響及探究其潛在的分子機制。參考文獻：1. Lopez-Otin, C., et al., The hallmarks of aging. Cell, 2013. 153(6): p. 1194-217.2. Kaeberlein, M., M. McVey, and L. Guarente, The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev, 1999. 13(19): p. 2570-80.3. Rogina, B. and S.L. Helfand, Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(45): p. 15998-6003.4. Childs, B.G., et al., Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(10): p. 718-735.5. van Deursen, J.M., The role of senescent cells in ageing. Nature, 2014. 509(7501): p. 439-46.6. Kennedy, B.K., et al., Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell, 2014. 159(4): p. 709-13.7. Sharpless, N.E. and C.J. Sherr, Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer, 2015. 15(7): p. 397-408.8. Bernardo, B.C., et al., Cartilage intermediate layer protein 2 (CILP-2) is expressed in articular and meniscal cartilage and down-regulated in experimental osteoarthritis. J Biol Chem, 2011. 286(43): p. 37758-67.9. Yao, Z., et al., Characterisation of cartilage intermediate layer protein (CILP)-induced arthropathy in mice. Ann Rheum Dis, 2004. 63(3): p. 252-8.10. Zhang, C.L., et al., Cartilage intermediate layer protein-1 alleviates pressure overload-induced cardiac fibrosis via interfering TGF-beta1 signaling. J Mol Cell Cardiol, 2018. 116: p. 135-144.11. Barallobre-Barreiro, J., et al., Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation, 2012. 125(6): p. 789-802.12. Zhang, C., et al., Genetic determinants of childhood and adult height associated with osteosarcoma risk. Cancer, 2018. 124(18): p. 3742-3752.13. Wu, T., et al., CILP-2 is a novel secreted protein and associated with insulin resistance. J Mol Cell Biol, 2019. 11(12): p. 1083-1094.14. Luptakova, L., et al., Association of CILP2 and ACE gene polymorphisms with cardiovascular risk factors in Slovak midlife women. Biomed Res Int, 2013. 2013: p. 634207.