該模型的創(chuàng)新型和應(yīng)用價(jià)值:

建立條件性基因敲除小鼠（血小板特異 NHE1-/-），更加準(zhǔn)確的研究單因素（血小板 NHE1）對于鹽敏感高血壓的作用，提高了結(jié)果的可靠性，可能成為鹽敏感性高血壓防治的新模型。

動(dòng)物模型制備過程中，由基因工程人員設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)及活性檢測，NHE1flox/flox小鼠與條件性敲除小鼠的繁育和鑒定均由具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上崗證的專人完成，飼養(yǎng)人員進(jìn)行日常飼喂，由獸醫(yī)進(jìn)行監(jiān)督管理，造模期間動(dòng)物狀態(tài)良好，病死只數(shù)0，未使用微生物，對環(huán)境沒有影響，造模方法可遺傳。

1、血小板活化結(jié)果分析

2、生理生化結(jié)果分析

3、病理結(jié)果分析

4、血小板生成超微結(jié)構(gòu)分析

1、模型設(shè)計(jì)原理：

GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時(shí)提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復(fù)方式進(jìn)行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。 NHE1-FloxP小鼠與組織特異性表達(dá)Cre小鼠交配，從而實(shí)現(xiàn)NHE1基因條件性敲除的目的。實(shí)驗(yàn)采用最新的spCas91.1進(jìn)行注射，減少了基因組中的off-Target。

2、動(dòng)物模型制備

2.1NHE1floxp/flox小鼠鑒定PCR結(jié)果分析

2.2 NHE1flox/flox, Plt Cre小鼠測序結(jié)果分析

經(jīng)鑒定1#和4#為NHE1flox/flox,Plt Cre 條件性敲除小鼠。

3. 標(biāo)本采集及處理

條件性敲除小鼠2月齡后，稱體重，麻醉后腹主動(dòng)脈采血至死亡，室溫靜置2h后于4℃ 3000r離心10分鐘提取血清，-80℃冰箱凍存。取心臟、主動(dòng)脈做石蠟切片，10%中性福爾馬林中固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片包埋劑包埋并切片；進(jìn)行免疫組化及免疫熒光檢測，其余血管組織液氮冷凍-80℃保存，提取蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測。

一、疾病概述

高血壓是一種由環(huán)境因素、遺傳因素和行為因素相互作用產(chǎn)生的復(fù)雜心血管癥狀，其中高鹽攝入是最重要的環(huán)境因素之一。我國目前高血壓患者已有2億多人，其中鹽敏感性高血壓患者約占總患者的50%。所謂血壓的鹽敏感性是指相對高鹽攝入所引起的血壓升高，且往往伴隨動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中、慢性腎病等更嚴(yán)重的靶器官損傷。目前約有62%的卒中事件和49%的心血管事件是由高血壓直接引起的。鹽敏感高血壓病理機(jī)制復(fù)雜，動(dòng)脈血管收縮及腎臟鈉水代謝潴留被認(rèn)為是主要發(fā)病機(jī)制之一。

我國目前抗高血壓藥物也主要通過舒張血管和利尿等方法降低血壓，但遺憾的是藥物治療的患者仍有近半數(shù)沒能有效控制血壓，更缺乏對靶器官損傷及相關(guān)并發(fā)癥的有效控制。

二、模型背景

1、造模因素信息

血小板NHE1基因條件性敲除小鼠模型

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

近年研究顯示慢性炎癥反應(yīng)在鹽敏感高血壓及心血管疾病發(fā)生中起重要作用。血小板活化引起的炎癥反應(yīng)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。活化的 P-selectin 激活血小板并粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，形成單核細(xì)胞-血小板連接，促進(jìn)白細(xì)胞化學(xué)趨化和內(nèi)皮組織炎癥浸潤，對心血管疾病的發(fā)展起重要的推動(dòng)作用[1]。

Na+/H+交換異構(gòu)體1（NHE1）是一種膜結(jié)合蛋白，它通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外Na+ /H+離子交換，來維持機(jī)體PH平衡和細(xì)胞容積穩(wěn)定。血小板表面廣泛分布的 NHE1 在血小板活化中起重要作用。血小板 NHE1 通過介導(dǎo)細(xì)胞外Na+內(nèi)流使得細(xì)胞中 Na+濃度升高，并通過NCX向細(xì)胞外泵出Na+交換性的增加血小板內(nèi)的Ca2+濃度而激活血小板[2]。

已有研究發(fā)現(xiàn)高鹽通過誘導(dǎo)血小板活化，參與了鹽敏感高血壓的發(fā)展。研究證實(shí)了鹽敏感性高血壓發(fā)生過程中，NHE1編碼基因在多種組織中異常增高[3-5], 與鹽敏感高血壓的發(fā)展密切相關(guān)，可能是鹽敏感高血壓防治的新靶點(diǎn)。為證實(shí)血小板 NHE1是否是高鹽誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及鹽敏感高血壓的重要靶點(diǎn)，我們制備條件性基因敲除小鼠并進(jìn)行了離體實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，NHE1-/-小鼠血小板NHE1表達(dá)量顯著低于對照小鼠，其血小板細(xì)胞經(jīng)高濃度 NaCl（160mmol/L）溶液培養(yǎng)后，與對照組（正常濃度NaCl，133mmol/L）比較，血小板活化率不增加。

參考文獻(xiàn):

1. Rondina MT, Weyrich AS, ZimmermanGA. Platelets as cellular effectors of inflammation in vascular diseases.Circulation Research. 2013;112: 1506-151

2. Huber, J.D., Bentzien, J., Boyer,S.J., Burke, J., De, L.S., Eickmeier, C., Guo, X.,Haist, J.V., Hickey, E.R., Kaplita,P., Karmazyn, M., Kemper, R., Kennedy, C.A., Kirrane, T., Madwed, J.B., Mainolfi,E., Nagaraja, N., Soleymanzadeh, F., Swinamer,A., Eldrup, A.B., Identification ofa potent sodium hydrogen exchanger isoform 1

(NHE1) inhibitor with a suitableprofile for chronic dosing and demonstrated cardioprotective effects in apreclinical model of myocardial infarction in the rat J. Med. Chem. 2012;55: 7114-7140.

3. Farjah M1, Roxas BP, Geenen DL,Danziger RS, Dietary salt regulates renal SGK1 abundance: relevance to saltsensitivity in the Dahl rat. Hypertension. 2003;41(4):874-8.

4. Gerhold D1, Bagchi A, Lu M,Figueroa D, Keenan K, Holder D, Wang Y, Jin H, Connolly B, Austin C,Alonso-Galicia M.Androgens drive divergent responses to salt stress in male versus femalerat kidneys.Genomics. 2007;89(6):731-44.

5. Rose P1, Bond J, Tighe S, TothMJ, Wellman TL, Briso de Montiano EM, Lewinter MM, Lounsbury KM.Genesoverexpressed in cerebral arteries following salt-induced hypertensivedisease are regulated by angiotensin II, JunB, and CREB.Am J Physiol Heart CircPhysiol. 2008;294(2):H1075-85.